新型冠状病毒的核酸检测方法

核酸是遗传信息的载体。1953年，沃森（Watson）和克里克（Crick）解析并证明DNA的双螺旋结构，正式开启分子生物学时代[4]。新型冠状病毒的遗传物质是一条单正义链RNA，其序列已被解析并公布（GenBank_MN908947）[5]。在基因组序列已明确的条件下，核酸检测是最常用的病毒快速检测技术。由于核酸是病毒的遗传物质，对病毒的特征序列进行扩增和检测就能判断样本中是否具有该病毒。

PCR检测技术
1985年，穆利斯（Mullis）完成世界上第一例聚合酶链式扩增反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），实现在体外对核酸分子进行大量扩增[6]。随后，以PCR为基础的分子诊断技术快速发展，广泛应用于疾病诊断[7-8]、疫情监测[9-10]、进出口检验检疫[11-12]和法医鉴定[13-14]等领域。

PCR反应的扩增过程包括三个步骤：

1）解链。通过高温变性打开双链之间的氢键，使其形成单链；

2）退火。低温条件下使引物与单链模板结合，形成引物-模板链的杂合双链形式；

3）延伸。DNA聚合酶最适温度条件下，引物沿着模板链延伸合成新的DNA双链。

完成25～35轮循环即可得到指数级扩增的目标核酸片段。根据已公布的新型冠状病毒SARS-CoV-2的基因组序列，通过生物信息学分析出具有特异性的目标DNA片段，设计用于PCR扩增的上下游引物，以病人样本中提取的RNA为模板，进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），如果检测到大量目标DNA片段，即可判定为阳性。新型冠状病毒的核酸检测流程如图1所示。
随着PCR技术的持续发展，对扩增产物的检测方法也在不断优化。第一代PCR技术主要通过琼脂糖凝胶电泳的方式对扩增产物进行验证，该方法存在操作繁琐，容易造成产物污染等问题，不建议作为致病性病毒的检测手段；第二代荧光PCR技术是在PCR扩增体系中增加了荧光物质，并将扩增效率与荧光强度进行偶联，通过荧光信号变化对检测结果进行判读。该方法不需要打开反应体系的盖子，不会对环境造成污染，并且具有实时、灵敏、快速、准确等优点，已成为新型冠状病毒的主流检测方法；第三代数字PCR技术是基于微流控方法将PCR扩增体系分配到上万个微液滴中，使每个阴性微滴不包含核酸分子，阳性微滴包含1个核酸分子（有时会包含不止1个核酸分子），同时显著降低样本中PCR抑制物的不利影响。

数字PCR技术可以实现对复杂样本中核酸分子的绝对定量且灵敏度较高，但是其配套试剂和设备极为昂贵，难以实现对大量样本的快速筛查和基层推广。基于数字PCR技术绝对定量的优越性和国内市场的迫切需求，以杭州博日生物科技有限公司为代表的国内医疗器械生产企业正在自主研发数字PCR仪和配套试剂，有望实现国产仪器的替代，显著降低数字PCR检测的成本。综合三代PCR技术的优缺点，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（试行第七版）将第二代荧光PCR技术作为新型冠状病毒疑似病例确诊的“金标准”[15]。

等温扩增检测技术
PCR反应过程中每一轮扩增都要经历3个温度梯度的变化，整个过程要经历25～35次循环，存在对仪器温控性能要求高，温度范围要满足0℃～100℃等缺点。因此，寻找一种准确、灵敏、快速，同时对仪器性能要求较低的技术，是实现对新型冠状病毒进行快速检测的迫切需求。

环介导的等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种核酸等温扩增技术[16]。针对目标序列的6个区域设计出3对特异性引物F3、B3、FIP、BIP、Loop F、Loop B，在嗜热脂肪芽孢杆菌链置换DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）作用下，可在60℃～65℃条件下实现核酸的恒温扩增，15～60min即可完成109～1010倍的核酸扩增[17]。扩增过程如图2所示。LAMP技术具有操作简单、扩增效果显著等优点，自2000年首次报道，已受到WHO和各国学者的广泛关注，在病原微生物的检测和传染性疫病的防控等方面具有广阔的应用前景[18-21]。
Lamb团队基于RT-LAMP技术开发了一种快速检测新型冠状病毒的方法，能在30分钟内快速检测出血清、尿液、唾液、口咽拭子和鼻咽拭子中的新型冠状病毒[23]。沈阳化工大学余林团队基于RT-LAMP技术开发了一种快速检测新型冠状肺炎病毒的iLACO方法，能够对低至10拷贝的ORF1ab基因进行鉴定[24]。

由于LAMP是一种恒温扩增技术，反应过程没有温度梯度的变化，因此不需要特殊的仪器。同时，LAMP具有终点可视的优点，DNA扩增过程析出大量的白色焦磷酸盐沉淀，肉眼即可判断结果是否为阳性，未经专业培训的人员也能独立完成操作。因此，基于LAMP技术开发的新型冠状病毒快速检测方法具有温度恒定、操作简单、不需要特殊仪器和人员等优点，为基层的疫情防控提供有力的技术支持。LAMP方法极为灵敏，检测过程中要严格控制，环境中、阴性对照中不能存在目标核酸分子，不然很容易出现假阳性的情况。此外，LAMP方法使用的Bst DNA聚合酶的耐热性和稳定性均不如Taq DNA聚合酶，因此成本较高，目前还难以满足大规模市场化的需求。